作者: Chinta Sidharthani博士，Lily Ramsey, llm 2024年9月18日
修饰核苷酸的应用，如N1-methylpseudouridine (N1Mψ)，在信使RNA (mRNA) 疫苗中能够有效减轻全身炎症反应，从而提升疫苗的效果。然而，mRNA疫苗的短半衰期和潜在的不良反应等问题仍然影响其疗效。
最近，波士顿大学的科学家们在《自然生物技术》期刊上发表了一项研究，探讨了在自我扩增RNA中使用修饰核苷酸是否能够克服mRNA疫苗的缺陷，并有效预防严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2) 的感染。
研究表明，使用修饰核苷酸的自我扩增RNA能够有效抑制干扰素反应，减轻鼻塞并增强疫苗效力。图片来源: KomootP/Shutterstock.com
背景
化学修饰的核苷酸已被广泛应用于mRNA疫苗中，以提高其细胞内的传递效率，增强mRNA分子的稳定性，并降低炎症免疫反应。这些修饰的核苷酸在开发针对2019冠状病毒病(COVID-19)的mRNA疫苗时发挥了重要作用。
与普通RNA相比，N1mΨ的使用能够有效防止toll样受体及其他免疫传感器的激活，从而提升疫苗的有效性。然而，由于mRNA疫苗的半衰期较短，通常需要更大且更频繁的剂量，这也增加了不良反应的风险。
自我扩增RNA（saRNA）能够在体内自我复制，少量剂量即可产生大量蛋白质，因此被视为mRNA的理想替代品。然而，saRNA可能引发早期免疫反应，从而降低其疫苗效力。
尽管在saRNA中使用化学修饰的核苷酸可能是一个潜在的解决方案，但这一方法尚未得到有效验证。
研究概述
本研究中，研究人员探讨了在saRNA构建体中使用不同修饰的核苷酸，以改善蛋白质表达和转染效率，从而增强基因治疗和疫苗的效果。
研究团队合成了一个saRNA构建文库，通过体外转录替换了修饰的核苷酸5-甲基尿嘧啶(m5U)、5-甲基胞苷(m5C)和5-羟甲基胞苷(hm5C)，并将报告蛋白编码到saRNA中。
随后，研究人员比较了hm5C和m5C修饰的saRNA与未修饰的saRNA及N1mΨ修饰的mRNA在HEK293T细胞中的转染效率。
采用阳离子脂质转染法，将带正电的脂质与saRNA结合，以促进其进入细胞并评估转染效果。
此外，saRNA还被装载到脂质纳米颗粒中，并转染到多种细胞类型，包括永生化的人T淋巴细胞Jurkat细胞和小鼠成肌细胞C2C12细胞。
在体外转录后，采用纤维素层析纯化RNA制剂，以去除双链RNA杂质，降低不良免疫反应。
通过用装载saRNA构建物的脂质纳米颗粒培养外周血单核细胞，研究了修饰和未修饰的saRNA对免疫系统的影响。
免疫应答通过分析细胞因子和干扰素相关基因的表达，特别是干扰素α和干扰素β的表达来评估。此外，使用小鼠模型进行了体内实验，脂质纳米颗粒包裹的saRNA通过肌肉注射给小鼠。
saRNA结构中编码了萤火虫荧光素酶基因，使得可以通过生物发光成像实时监测蛋白质的表达。同时，定期分析小鼠的血清样本以测量干扰素水平并评估全身免疫反应。
研究还测试了编码SARS-CoV-2刺突蛋白基因的saRNA构建体的剂量反应。使用不同剂量的saRNA疫苗的小鼠在遭受致命的SARS-CoV-2变体攻击后，通过测量血液中中和抗体的水平来评估疫苗的效果。
主要发现
研究结果显示，含有hm5C和m5C的修饰saRNA的转染效率显著高于标准的未修饰saRNA构建体。在HEK293T细胞中，含有m5C的saRNA的蛋白表达水平比未修饰的saRNA高出4.9倍，比N1mΨ修饰的mRNA高出68倍。
转染后，m5C修饰的saRNA表达稳定，持续时间可达一周。m5C修饰的saRNA在三种细胞系中的蛋白表达均明显优于未修饰的saRNA和N1mΨ修饰的mRNA。
体内实验结果表明，与未修饰的saRNA相比，m5C修饰的saRNA在28天内保持稳定的蛋白表达，并且炎症免疫反应显著降低。
即使在低剂量下，m5C修饰的SARS-CoV-2 saRNA疫苗也能显著提高小鼠的存活率，其诱导的中和抗体滴度明显高于未修饰的saRNA和N1mΨ修饰的mRNA。
结论
总体而言，研究表明在saRNA构建体中使用化学修饰的核苷酸m5C显著提升了转染效率和蛋白表达。此外，使用m5C修饰的saRNA编码SARS-CoV-2刺突蛋白作为疫苗，相较于未修饰的saRNA，具有更高的存活率和更低的炎症反应。
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希望本篇文章《提升saRNA疫苗效力及对SARS-CoV-2的防护效果：核苷酸修饰的作用》能对你有所帮助！
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